3/1:20432
2.4.32 ОБЩИЙ ХОЛЕСТЕРИН В МАСЛАХ С ПОЛИНЕНАСЫЩЕННЫМИ
ЖИРНЫМИ ОМЕГА-3 КИСЛОТАМИ
Испытание может быть использовано для количественного определения общего
содержания свободного и этерифицированного холестерина в лекарственных средствах
животного происхождения с различной концентрацией омега-3 кислот. Холестерин в
маслах с полиненасыщенными жирными омега-3 кислоты присутствует в продуктах из
рыбьего жира, жира печени рыб.
Для количественного определения свободного и этерифицированного холестерина
применяют метод газовой хроматографии с пламенно-ионизационной детекцией (2.2.28).
Основной раствор внутреннего стандарта. 0.15 г (5α)-холестана Р растворяют в гептане
Р и доводят объем тем же растворителем до 50.0 мл. Допускается хранение раствора
внутреннего стандарта в морозильной камере до 6 мес.
Рабочий раствор внутреннего стандарта. Готовят непосредственно перед
использованием. 1.0 мл основного раствора внутреннего стандарта доводят гептаном Р до
объема 10.0 мл.
Основной раствор холестерина. 50.0 мг холестерола Р растворяют в гептане Р и доводят
объем раствора до 100.0 мл тем же растворителем. Основной раствор может храниться в
морозильной камере до 6 мес.
Рабочий раствор холестерина. Готовят непосредственно перед использованием. 1.0 мл
основного раствора холестерина растворяют в гептане Р и доводят объем раствора до 10.0
мл тем же растворителем.
Основной раствор холестерина и α-токоферола. 50.0 мг холестерина Р и 50.0 мг α-
токоферола Р растворяют в гептане Р и доводят объем раствора до 100.0 мл тем же
растворителем. Раствор можно хранить при комнатной температуре до 3 мес.
Раствор сравнения. Готовят раствор в день использования. 1.0 мл основного раствора
холестерина и α-токоферола растворяют в гептане Р и доводят объем раствора до 100.0 мл
тем же растворителем.
Калибровочные растворы. Готовят растворы в день использования. Навеску для каждого
калибровочного раствора, согласно данным таблицы 2.4.32.−1, доводят 10% (об/об)
раствором этилацетата Р в гептане Р до объема 20.0 мл.
При высоком содержании холестерина (от 3.0 до 20.0 мг/г) используют все 5
калибровочных растворов.
При низком содержании холестерина (от 0.2 до 3.0 мг/г) используют калибровочные
растворы: 0.2 мг/г, 1.0 г/г и 3.0 мг/г.
Таблица 2.4.32.-1. — Подготовка калибровочных растворов
Калибровочные растворы
Основной
раствор
холестерина
(мл)
Рабочий
раствор
холестерина
(мл)
Рабочий
раствор
внутреннего
стандарта
Концентрация
холестерина
(мг/мл)
Концентрация
холестерина
(мг/г)*
(мл)
0.1
20.0
4.0
1.0
0.05
10.0
2.0
1.0
0.015
3.0
0.60
1.0
0.005
1.0
2.0
1.0
0.001
0.2
0.40
1.0
* из расчета навески в 0.100 г испытуемого образца
Испытуемый раствор. 0.100 г испытуемого образца субстанции помещают в термостойкую
кварцевую пробирку на 15 мл (если образец имеет неоднородную консистенцию, то перед
взвешиванием его энергично встряхивают в подходящей емкости, отстаивают от 10 мин до
15 мин, удерживая емкость в вертикальном положении, для взвешивания отбирают часть из
среднего слоя). В пробирку с навеской испытуемого образца добавляют 1.0 мл рабочего
раствора внутреннего стандарта. Содержимое пробирки упаривают досуха при температуре
50° С и пропускании через раствор слабого потока азота Р. Добавляют 0.5 мл 50% раствора
(м/м) калия гидроксида Р и 3.0 мл этанола (96%) Р. Наполняют пробирку азотом Р,
закрывают пробкой и гомогенизируют при 100° C в течение 1 ч. Охлаждают в течение 10
минут, добавляют 6.0 мл воды дистиллированной Р и гомогенизируют, получая гомогенную
смесь с омыленным веществом. Кондиционируют колонку для твердофазной экстракции
(ТФЭ) (приводят сорбент в активное состояние). Колонка объемом 20 мл, содержит 1 г
силикагеля октадецилсилильного эндкепированного для хроматографии Р (частицы
диаметром 55 мкм и размером пор 7 нм) и 5 мл 50 % (об/об) этанола (96 %) Р в воде
дистиллированной Р. Вносят 5.0 мл гомогенной смеси в колонку ТФЭ, следя за тем, чтобы
колонка была постоянно влажной. Промывают колонку 5.0 мл 50% (об/об) этанола (96%) Р
в воде дистиллированной Р. Элюирование проводят, используя 20.0 мл 10 % (об/об)
раствора этилацетата Р в гептане Р. Полученный элюат используют в качестве
испытуемого раствора.
Условия хроматографирования:
− колонка капиллярная из термостойкого кварца длиной 15 м и внутренним диаметром
0.25 мм, покрытая фенил(5)метил(95)полисилоксаном Р толщиной 0.25 мкм;
− газ-носитель: гелий для хроматографии Р;
− давление: 48 кПа (соответствует скорости газа-носителя примерно 0.6 мл/мин при 200
°C и примерно 0.4 мл/мин при 330 °C);
− деление потока: 1:5;
– режим изменения температуры:
Время
(мин)
Температура (°C)
Колонка
0−1
200
1−7.5
200 → 330
7.5−10
330
Блок ввода проб (инжектор)
250
Детектор
340
До начала испытания колонку прогревают до 340 °С не менее 30 мин при указанном
давлении;
− детектор: пламенно-ионизационный;
− объем вводимой пробы: 1 мкл;
− время удержания: (5α)-холестана около 7.5 мин, холестерина около 9 мин;
− калибровочная кривая: строят калибровочную кривую, отмечая по оси абсцисс (ось х)
номинальную концентрацию холестерина в каждом из калибровочных растворов в
миллиграммах на грамм, по оси ординат (ось y) отмечаем отношение площади пика
холестерина (А
1
) к площади пика (5α)–холестана (А
2
)
на хроматограмме, полученной от
каждого из калибровочных растворов. Рассчитывают наклон (S) и пересечение с осью
ординат (ось y).
Пригодность хроматографической системы:
– разрешение: не менее 1.5, между пиками холестерина и α-токоферола на хроматограмме
раствора сравнения;
– коэффициент детерминации (R
2
) калибровочной кривой составляет не менее 0.995.
Содержание общего холестерина в испытуемом веществе (в миллиграммах на грамм)
рассчитывают по формуле:
где:
A
1
− площадь пика холестерина на хроматограмме испытуемого раствора;
A
2
− площадь пика (5α)-холестана на хроматограмме испытуемого раствора;
m
1
− навеска субстанции в испытуемом растворе в граммах;
Y − переcечение калибровочной кривой с осью ординат (ось y);
S − наклон калибровочной кривой, в граммах на миллиграмм.
